PNAS:首次!无需添加发色团,直接细胞合成!利用“升级版”光系统操纵细胞信号传导|照亮活体动物

APExBIO2019-02-10 14:18:27

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研究意义

利用光学来控制细胞信号传导,近年来引起了研究者们的极大兴趣。例如蛋白质活性可以通过几种光诱导二聚化系统来调节。大多数光遗传学系统都使用蓝光,荧光指示器如基于FRET的生物传感器也是如此。PhyB–PIF(植物色素B-光敏色素互作因子)系统是一种广泛使用的红光/远红光可切换的二聚化诱导系统。然而,PhyB需要发色团(如PCB),因此应用该系统前必须将发色团人为地添加到哺乳动物细胞中,这给科学家们造成了很多不便。为了克服这个困难,来自日本京都大学大学院医学研究科的研究团队开发了一种在哺乳动物细胞中有效合成PCB的系统。发现PCB可通过引入PcyA,HO1,Fd和Fnr这4个基因进行合成。这种遗传编码的PCB合成系统允许通过红外/远红光来操纵细胞信号传导,重要的是,不需要任何外源PCB的添加。这是首次成功利用PCB生物合成系统在哺乳动物细胞中操作PhyB-PIF系统的研究,对于PhyB-PIF系统在活体动物中的研究具有重要意义。

 

细胞内信号转导通路相当于信息处理系统,输入的信号作为信息被处理,随后产生输出行为即细胞表型。这些通路包含一系列生化反应,相互作用形成高度复杂的网络。

 

能够快速和可逆地扰乱细胞系统的方法对于分析靶向药物的作用至关重要。化学诱导二聚化(chemical-induced dimerization,CID)系统广泛用于生物研究,简单来讲是当加入某种药物(小分子、酶或者某种二聚剂)时,会引起分开的两个蛋白质结合,当每个蛋白单体上的激活或抑制原件相互靠近并形成二聚体时,会引起激活或抑制作用,即最终实现用药物控制活性开关。虽然CID系统已经广泛用于通过小化合物快速扰乱细胞信号传导,但是大多数CID系统是不可逆的,并且难以在亚细胞水平上操纵二聚化。


图 化学诱导二聚化。在二聚剂(蓝色)的存在下,通常不相互作用的两种蛋白质发生了结合。

 

后来,科学家们开发了几种光诱导二聚化(light-induced dimerization LID)系统,其中可光活化的蛋白质可被光二聚化,目标是利用光来开启和关闭基因的表达,这种方式是可逆的。其中,CRY2-CIB1(隐花色素2-整合素结合蛋白1)系统已被广泛用于基于光诱导二聚化来控制细胞信号传导。即,暴露于蓝光后的几秒钟内,CRY2的构象发生变化,使它与CIB1结合,当暴露于黑暗条件下,该复合物会在几分钟内离解。CRY2蛋白利用黄素(flavin)作为发色团(chromophore)。然而,这个系统有潜在的缺点。首先,解离反应具有缓慢的动力学,并且是不可控制的。第二,使用蓝光进行CRY2-CIB1的光活化与基于GFP的生物传感器如FRET的荧光成像不兼容。

 

目前,PhyB -PIF(植物色素B-光敏色素互作因子)系统是唯一在长波长光下工作的LID系统。藻胆青素(phycocyanobilin,PCB)或植物色素(phytochromobilin)作为PhyB的光吸收发色团,相互结合。在红光照射下,PhyB在几秒钟内结合PIF,并且所产生的PhyB-PIF复合物在远红光照射下几秒钟内解离。基于PhyB-PIF系统可以快速、可逆地控制光的结合和解离能力,研究人员利用该系统可以在空间和时间上以更高分辨率来操纵细胞信号。

 

然而,PhyB-PIF系统也有一个关键的缺点。那就是光敏感系统需要这种叫作发色团(色基)的化学物质,而发色团仅在光合生物体中产生,如果科学家想要研究的细胞不能生成这种色基,科学家在应用光敏感系统前就要进行添加。因此会带来很多的不便。

图 蓝藻中PCB合成的途径。两种酶,血红素加氧酶(heme oxygenase)和铁氧还蛋白依赖性胆碱还原酶(ferredoxin-dependent bilin reductase)利用血红素(heme)进行植物色素生物合成。在光合生物如蓝藻中,PCB是通过HO1介导的血红素降解和PcyA介导的胆红素(biliverdin)还原而产生的。


为了克服这个问题,人们在细菌和哺乳动物细胞中构建了PCB生物合成系统,通过表达两种生物合成酶,血红素加氧酶1(HO1)和铁氧还蛋白(Fd)氧化还原酶(PcyA)。然而,到目前为止,没有人能成功利用PCB生物合成系统在哺乳动物细胞中操作PhyB-PIF系统,这可能是因为测试的生物合成系统不能为PhyB-PIF系统产生足够量的PCB。来自京都大学大学院医学研究科的Uda等人证明,利用HO1和PcyA将Fd和Fd-NADP +还原酶(Fnr)共表达,在哺乳动物细胞中成功合成了PCB。

 

作者表达了一种合成基因PHFF来诱导PCB合成,该合成基因PHFF由四个基因PcyA,HO1,Fd和Fnr组成,它们源自T. elongatus BP-1或Synechocystis sp。在初步实验中,源自嗜热藻(T. elongatus BP-1)的HO1和PcyA不足以在哺乳动物细胞中操作PhyB-PIF系统。可能是由于缺乏Fd和Fnr。由于血红素主要存在于哺乳动物细胞中的线粒体,Uda等人试图共表达源自集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)的Fd和Fnr,在人细胞中重构PCB合成途径。采用PhyB的Tyr-276-His突变体(PhyB-Y276H)来量化活细胞中的PCB,其在结合PCB时发出红色荧光。令人惊讶的是,当MTS(线粒体靶向序列)-Fd和MTS-Fnr与MTS-PcyA和MTS-HO1共表达时,来自HeLa细胞的PhyB-Y276H的红色荧光几乎与在2.5μM PCB存在下观察到的相似。排除这四个基因中的任何一个可以消除细胞的荧光。为了促进基因传递,这四个基因与自切割P2A肽的cDNA连接,产生合成基因“PHFF”,来合成PCB。用pPHFF表达载体转染PHLH的HeLa细胞从PhyB-Y276H发出红色荧光,其水平与独立表达四种基因的细胞相当。


 图 PhyB-Y276H结合PCB时发出红色荧光。


图 PHFF合成基因。


图 PhyB–PIF 系统。

 

用四种组合(PhyB- PIF3,PhyB- PIF6,PhyB621- PIF3,PhyB621- PIF6)检查PhyB与PIF的结合情况。具体为分别用pPHFF在质膜和细胞溶质中共表达PhyB-mCherry-HRasCT和PIF-mEGFP,并别用红光和远红光照射细胞以分别打开和关闭质膜上PIF-mEGFP与PhyB-mCherry-HRasCT的结合。发现PIF3具有比PIF6更快的结合和解离速率。因此,PIF3在PhyB-PIF系统中作为PhyB的结合伙伴将比PIF6更适合。

 

通过CRISPR / Cas9介导的基因KO(敲除)或shRNA来消耗胆红素还原酶A(BVRA)导致PCB合成的增强,从而增加PhyB-PIF LID的效率。BVRA,其分别将胆绿素和PCB分解为胆红素和藻胆青素。没有观察到PHFF表达和/或BVRA KO对HeLa细胞和小鼠胚胎干细胞生长速率的任何影响。

 

此PhyB-PIF系统广泛应用于操纵细胞信号转导。已知Rac1(一种小GTP酶)的激活导致肌动蛋白重组和层状隆起形成。红光的暴露导致在表达sh-hBVRA的HEK-293细胞的周边形成薄片层状突触,表明光的照射激活了Rac1。



图 利用此PhyB-PIF系统操纵细胞信号转导。A~C. 红光激活了Rac1。暴露于红光后,Tiam1-PIF3-mEGFP(Rac1激活因子)被转移至质膜,导致Rac1的激活。D.红光激活ERK MAP激酶途径。通过PhyB-PIF LID将CRaf-PIF3募集到膜中导致ERK激活。


PhyB-PIF系统的一个优点是它能够利用一个GFP报告基因或基于CFP / YFP的FRET生物传感器来操作细胞信号和检测输出信号。通过红光将CRaf-PIF3募集到质膜中,可以激活ERK MAP激酶途径,并利用EKAREVNLS(ERK FRET生物传感器)监测随后的ERK激活。重要的是,用于FRET生物传感器的激发光引起轻微的PhyB活化,因此,可通过远红外光全局照射来防止非特异性激活。在红光照射下,与ERK活性相关的FRET / CFP比率增加,并且这种增加被远红光照射抑制。

 

总之,光遗传学是在空间和时间上精确操纵细胞信号的强大工具,自2015年科学家结合光遗传学和CRISPR技术,各种光激活的CRISPR工具被开发出来,这些工具能够利用光从外部控制基因的编辑和蛋白的表达。作者构建的这个表达载体,共同表达HO1,PcyA,Ferredoxin和Ferredoxin-NADP +还原酶,在哺乳动物细胞的线粒体中有效合成PCB。降低BVRA可以实现更高的细胞内PCB浓度。值得注意的是有研究显示BVRA基因的消耗可能改变胰岛素信号。因此,需要新的研究策略来改善PCB合成而不影响BVRA功能。总之,PhyB-PIF系统可以利用光学调节细胞内信号传导而不需要添加任何外部的发色团,该篇研究为PhyB-PIF系统应用于活体动物铺平了道路。未来,遗传编码的PCB合成系统将会为建立稳定地内源性合成PCB的转基因动物提供潜在的优势,从而使得能够在更深层的组织中进行细胞信号传导的光遗传操作,而无需注入发色团如PCB。未来的研究中还应该探讨胆绿素结合PhyB的突变体或其它植物色素。

 

原始论文:

Efficient synthesis of phycocyanobilin in mammalian cells for optogenetic control of cell signaling.

PNAS; published ahead of print October 24, 2017.


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